小麦结构域中的保守残基是蛋白质结合所必需的对植物意义重大
文 | 世纪凡说
编辑 | 世纪凡说
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NAC转录因子是一大类植物特异性转录因子。NAC调节广泛的生物过程，包括许多发育的基础，如侧根形成、枝尖分生组织发育和叶片衰老。
它们还调节广泛的非生物和生物胁迫反应，虽然许多最早的研究是在拟南芥等模式物种中进行的，但越来越多的作物物种研究发现，NACTFs是各种农艺相关性状的重要调节因子。
例如，在小麦中，NACTFs参与调节非生物和生物胁迫反应，以及参与确定谷物质量的性状。
一、NAC转录因子的特征
NAC转录因子的特征是在蛋白质的N末端有一个高度保守的NAC结构域，其次是C末端的一个非保守的、固有的无序区域。
NAC结构域由五个亚域组成，这些子结构域本身在整个植物界中高度保守，并且具有关键的功能作用。
拟南芥的早期研究表明，NACTFs以同源或异二聚体的形式结合DNA，并且需要这种二聚化来稳定DNA结合。
NAC结构域以同源二聚体形式结晶，使蛋白质二聚化界面定位于子结构域i和II。
后来，NAC二聚体与DNA结合的晶体结构鉴定出位于DNA-蛋白质相互作用界面的亚域iii、iv和v中的残基。
二、NAC结构域的其他残基对蛋白质二聚化的作用尽管它们很重要，但目前尚不清楚NAC结构域内的残基在不同NAC转录因子以及不同物种之间具有共同功能的程度。
早期的工作表明，拟南芥ANAC019NAC结构域亚域iii中特定残基的突变导致体外DNA结合的丧失。进一步的研究确定了ANAC019中蛋白质二聚化所必需的一对残基。
最近，ANAC019NAC结构域内的各种残基已被预测在NAC结构域的pH依赖性稳定中起作用。
然而，据我们所知，没有NAC结构域的其他残基在实验上被证明是蛋白质二聚化所必需的，上述残基也没有被证明在植物中具有生物学显着的作用。
三、NAC转录因子对植物的影响
在小麦中，NAC转录因子先前已被证明是衰老的阳性调节因子。在现代六倍体和四倍体小麦中，该基因要么没有功能，要么被删除。
随后在六倍体小麦中的工作表明，A基因组同源物NAM-A1的截断突变体本身足以导致叶片衰老的显著延迟。
在一些测试环境中，NAM-A1的丢失也导致谷物蛋白质含量降低，尽管这不如D基因组截断或双A和D基因组突变体严重。
NAM-A1的类似截断变异也被证明可显著延缓四倍体小麦的叶片衰老，这也对应于GPC的显著降低。
然而，尚不清楚错义突变中的NAM-A1等位基因变异在多大程度上会影响这些表型。
此外，尽管这些研究报告了NAM-1突变体的花梗通常保持绿色，但没有一项研究专门探讨了NAM-A1在调节花梗衰老中的作用。
四、靶向诱导的基因组局部病变资源对植物的影响
最近，计算机TILLING资源为四倍体和六倍体小麦的点突变变异提供了无与伦比的来源。
由于小麦的多倍体性质，与通常用于二倍体植物相比，更高剂量的诱变化学物质乙基甲烷磺酸盐可用于耕作种群的生产。
这导致了一组突变密集的系，这些系在外显子组捕获后被测序，现在可以通过EnsemblPlants轻松询问。
当与最新的基因组参考进行映射时，99%的测序小麦基因至少有一个错义突变，每个基因平均有30个错义等位基因。
这为植物研究中特定残基在蛋白质功能中的作用提供了有用的资源。
五、NAC结构域中的错义突变对植物的影响在这里，我们利用计算机TILLING资源中的四倍体来研究特定错义突变对NAM-A1的影响。
与大多数小麦基因作为功能拷贝存在于四倍体小麦的两个基因组中的每一个不同，NAM-A1的B基因组拷贝是非功能性的。
因此，我们可以在二倍体背景下研究特定突变对NAM-A1的影响。我们在NAC结构域中发现了一组五种错义突变，这些突变被预测为高度有害。
基于这些突变，我们表征了它们对植物旗叶和花梗衰老和细胞死亡的影响。我们还评估了它们在体外防止蛋白质结合的能力。
我们确定了导致植物衰老延迟和蛋白质结合能力丧失的四种残基。我们认为这些残基的功能可能在物种之间是保守的，并且这些残基是NAM-A1功能所必需的。
六、蛋白质结合结构域中的突变对植物的反应为了确定错义突变如何导致衰老延迟，描述了它们对蛋白质功能的影响。以前，已经对小麦NAM-B2蛋白进行了酵母双杂交筛选，该蛋白将NAM-A1同源物鉴定为推定的结合伴侣。
我们通过酵母双杂交和免疫共沉淀证实了这种相互作用，证明NAM-B1和NAM-A1可以在体内相互作用。
然后，我们使用这种已知的相互作用来测试NAM-A1保守残基中的选定突变是否导致与NAM-B1的蛋白质相互作用丧失。
NAM-A1的突变等位基因克隆了KronosTILLING系中发现的相应突变，相同的残基也突变为丙氨酸残基，以测试任何表型是由于TILLING系中的特定突变，还是由于保守残基本身的功能特性。
Y1H中仅使用NAM-A2等位基因的NAC结构域来防止C端转录激活结构域自动激活酵母GAL4启动子。
先前已观察到由Y2H测定中NAC转录因子的C端结构域引起的自动激活，表明NAC转录因子具有转录激活剂的作用。去除C端结构域预计不会显著改变蛋白质二聚化特性。
筛选选择性培养基上的相互作用发现，在保守残基中的五个错义突变中，有四个导致与TILLING和丙氨酸突变的相互作用完全丧失。
这包括预测蛋白质结合域中的三个突变等位基因和预测DNA结合域中的两个等位基因之一。
一个突变仅部分降低了结合NAM-B1的能力，因为与对照组相比，它显示出TILLING突变体的相互作用水平降低。
然而，这种相互作用在丙氨酸突变中完全恢复。所有对照在选择性条件下都保留了相互作用，包括K133中非保守氨基酸C2551Y的错义突变。
七、错义突变对细胞死亡的作用在Y2H筛选之后，我们暂时过表达本氏烟草中的NAM-A1等位基因，以确定它们对细胞死亡反应的影响。细胞死亡在萎黄和酚类化合物的积聚导致自发荧光均进行评分。
野生型NAM-A1的过表达导致细胞死亡表型与弱超敏反应期间观察到的相似，萎黄和自发荧光的证据明显高于模拟，这与NAM-A1在小麦中作为衰老正调节因子的作用一致。
然后，我们筛选了NAM-A1突变等位基因，包括TILLING和丙氨酸突变体，以减少细胞死亡反应。
一般来说，我们发现两种评分细胞死亡的方法与Y2H筛选中观察到的蛋白质相互作用的丧失密切相关。
在酵母中蛋白质相互作用完全丧失的四个突变等位基因中，与野生型NAM-A1相比，6个也显示出显着减弱的萎黄和细胞死亡反应。
只有显示蛋白质相互作用丧失的P154S对细胞死亡反应没有影响。部分减少蛋白质相互作用的P0L取代在其萎黄反应中也具有临界显着性。
两个对照等位基因均未显示萎黄或细胞死亡减少，包括非保守错义突变。使用蛋白质印迹验证所有构建体的蛋白表达。
八、NAM-A1突变体对花梗衰老的影响
我们对NAM-A1突变体等位基因系列的研究还强调，虽然NAM-A1的突变可导致旗叶衰老延迟，特别是在田间，但在温室和田间试验中对花梗衰老也有强烈而显着的影响。
值得注意的是，旗叶和花梗视觉衰老的性状确实不同。当25%的叶子变黄时，对旗叶衰老进行评分——这是衰老开始的衡量标准。
相比之下，当花梗的顶部英寸完全黄色时，就会对花梗衰老进行评分——这是衰老终止的衡量标准。这种差异是由于确定花梗何时开始衰老所固有的困难。
大多数情况下，旗叶的衰老以定向方式发生，从叶子的尖端向基部移动。相比之下，花梗衰老可以同时发生在茎周围，因此很难确定明确的衰老开始位置和时间。
SPAD测量的旗叶衰老进程也允许对旗叶的衰老终止进行评估。可以与花梗衰老的视觉测量进行更有意义的比较。在NAM-A1突变体的温室实验中观察到花梗衰老的显着延迟。
使用SPAD测量的任何突变体都没有观察到旗叶衰老进程的显著延迟。在野外的NAM-A3突变体中也观察到了类似的结果。该数据证实了在比较视觉衰老评分时观察到的。
也就是说，在温室和田间实验中，NAM-A3突变体对花梗衰老的影响比对旗叶衰老的影响更严重和实质性。
以前对NAM基因的研究主要集中在旗叶衰老表型上，尽管已经注意到延迟的花梗衰老表型。 众所周知，NAM基因调节营养物质重新动员到穗中，穗必须通过花梗才能到达谷物。
NAM-1敲除系的收获时花梗氮含量较高，而NAMRNAi敲除系显示谷物中微量营养素水平的改变。
早期的研究未能在14DAA下鉴定出NAM基因在花梗组织中的任何表达，最初表明NAM基因可能间接作用于花梗中的营养物再动员和衰老。
然而，来自综合发育时间过程的最新RNA-Seq数据已经确定了籽粒灌浆过程中花梗中NAM基因的表达。
在可用于花梗组织的最新时间点，所有NAM基因在花梗中的水平高于它们在旗叶中的水平，支持NAM基因在花梗中的直接作用。
这证实了最近的表达分析，该分析发现，与7DAA的旗叶叶片相比，花梗中NAM基因的表达水平更高。
人们很容易推测突变的NAM-A1等位基因延缓了花梗的衰老，从而将营养物质封存在花梗中，阻止了它们运输到谷物中。
对这一假设的支持来自对NAM家族RNAi敲低系的工作，该工作表明，突变系在衰老期间在花梗中保留的铁、锌、氮和果聚糖含量明显高于野生型系。
与其他组织相比，了解旗叶衰老是可以理解的，因为旗叶提供了大部分重新动员到谷物中的糖和营养物质，使用无损SPAD计相对容易测量旗叶衰老的进展。
除了对黄变进行视觉评分之外，花梗衰老的定量评分还依赖于对色素含量的破坏性测量。
我们的研究结果表明，了解控制花梗衰老的时间和调控机制对于了解旗叶衰老如何影响籽粒质量和产量也是必要的。
九、总结
NAC转录因子包含五个高度保守的亚结构域，它们是蛋白质二聚化和DNA结合所必需的。
这些亚域中很少有残基被确定为蛋白质功能所必需的，并且更少的残基仍然被证明在植物中具有生物学相关性。
在这里，我们使用小麦衰老的阳性调节因子NAM-A1来测试NAC结构域的特定高度保守残基的错义突变对蛋白质功能的影响。
我们将NAC域中关键残基的计算机预测与生化和植物研究相结合，研究它们在NAM-A1功能中的作用。
使用KronosTILLING群体，我们能够在温室和田间快速识别和筛选NAM-A1的错义突变。在确定了导致蒂衰老延迟的四个突变体后。
我们使用酵母2杂交系统表明突变导致蛋白质相互作用的丧失，并表明这是突变体破坏蛋白质功能的机制。
这些突变的特征证实了先前在拟南芥中进行的NACTFs的工作，并确定了蛋白质功能所需的先前未表征的残基。
展望未来，这提供了一种使用小麦深入表征其他保守蛋白质结构域的方法，然后可以与其他物种中产生的知识相结合。
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